Southern blot
Separación electroforética: el primer paso es digerir el ADN diana con enzimas
de restricción. Los fragmentos resultantes se separan según su tamaño mediante
electroforesis en gel. Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN cargados
negativamente debido a los grupos fosfato migran desde el polo negativo hacia
el positivo a través de un gel poroso de agarosa. Los fragmentos pequeños
corren más rápido y a medida que aumentan de tamaño se desplazan a menor
velocidad.
• Desnaturalización: tras la electroforesis, los fragmentos de ADN se hidrolizan
parcialmente con un ácido débil y se desnaturalizan con una base fuerte, para
permitir la transferencia.
• Transferencia: debido a la fragilidad de los geles de agarosa y para que los
fragmentos de ADN no se desplacen por el gel, el ADN se transfiere a un filtro de
nitrocelulosa o de nailon. Los fragmentos de ADN quedan inmovilizados en
distintas posiciones según su tamaño.
• Hibridación: en este momento los fragmentos monocatenarios de ADN diana
fijos en el filtro de nitrocelulosa se pueden asociar (hibridar) con sondas
monocatenarias de ADN marcadas. Durante la incubación las sondas hibridarán
sólo con las secuencias de ADN diana complementarias y su posición en la
membrana puede correlacionarse con el gel para estimar su tamaño.
• Detección: la sonda unida a la diana complementaria se puede visualizar de una
manera sencilla en el filtro, mediante la exposición a rayos X (si se han utilizado
sondas con marcado radioactivo) o con una película sensible a la luz (si se han marcado las sondas con fluorocromos). Su posición en la membrana puede correlacionarse con el gel para estimar su tamaño.
destaca:
- Elaboración de huellas genéticas
o El estudio de mutaciones estructurales
o La detección de secuencias adquiridas
Protocolo microarray
en todos los protocolos hay unos pasos comunes:
Marcaje de la muestra: las sondas fijadas al microrray no están marcadas, por lo que el primer paso de la técnica consiste en marcar la muestra con un fluorocromo.
Hibridación y lavados posthibridación: se llevan a cabo siguiendo la rigurosidad
recomendadas por el fabricante.
Lectura del microarray: se realiza mediante escáner que dispone de luz láser que excita cada punto de la matriz con la longitud de onda adecuada al fluorocromo utilizado y de un detector que mide la intensidad de la fluorescencia emitida por cada punto de la
matriz.
Análisis e interpretación de los resultados: se realiza mediante software específico.
CARACTERÍSTICAS DE LAS TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN IN SITU
• No requiere la extracción y purificación previa de ácidos nucleicos
• Es relativamente rápida y sencilla, con un coste económico moderado.
• Se puede realizar sobre material fresco, congelado e incluso fijado en formol e incluido en parafina.
• Permite obtener información a nivel de célula individual en relación con el resto del tejido.
• Posibilita la realización de estudios retrospectivos.
• Utiliza sondas no radioactivas, tanto de ADN, como ARN y PNA
Protocolo fish
HIBRIDACIÓN:
La hibridación se realiza directamente sobre la preparación, aplicando 5 ul de la sonda marcada en el área de hibridación y colocando encima un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas.
El portaobjetos se coloca sobre una placa calefactora a 72ºC durante 4-5 minutos para
desnaturalizar el ADN de la muestra y la sonda (en el caso de sonda de ADN bicatenario) Transcurrido ese tiempo se coloca el portaobjetos en una cámara húmeda para evitar la desecación y se incuba en estufa a temperatura recomendada por el fabricante de la sonda (37-42ºC) durante 12-16 horas para que tenga lugar la hibridación.
LAVADO POSHIBRIDACIÓN:
El lavado o lavados de poshibridación se realizan por inmersión de los portaobjetos en
soluciones de lavado colocadas en cubetas Coplin, una vez retirados los cubreobjetos.
CONTRATINCIÓN:
Se sacan los portaobjetos de la cubeta Coplin, se elimina el exceso de solución de lavado colocándolos en posición vertical sobre papel de filtro.
Se dispensan 5-7 ul de solución de contratinción sobre el área de hibridación y se coloca encima un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas. La solución de contratinción contiene diamino-fenil-indol (DAPI) por lo que al excitar la preparación con luz ultravioleta los núcleos muestran flourescencia azul. Los portaobjetos pueden visualizarse inmediatamente con un microscopio de florescencia o conservarse en nevera a 2-8ºC preservados de la luz.
VISUALIZACIÓN
Las preparaciones se visualizan con un microscopio de florescencia con los filtros adecuados a los fluorocromos utilizados en las sondas.
Protocolo cish
DESPARAFINADO Y REHIDRATACIÓN
El primer paso de cualquier técnica que se quiera realizar sobre tejidos incluidos en parafina es eliminar la parafina y volver a rehidratar el tejido.
Esto se consigue mediante inmersión sucesiva de los portaobjetos con las secciones de tejido en cubetas con disolventes orgánicos, como el xilol, para eliminar la parafina y alcoholes de degradación decreciente (100%, 96%, 70%) hasta agua destilada o tampón para rehidratar el tejido.
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
Durante la fijación, el formol produce enlaces entrecruzantes entre las proteínas y otras
macromoléculas.
El tratamiento enzimático libera a los ácidos nucleicos de su unión a histonas y otras proteínas y permeabiliza el tejido para que las sondas puedan acceder libremente a su secuencia diana.
Las dos enzimas más utilizadas son la proteinasa K y la pepsina.
PREHIBRIDACIÓN
La finalidad de la prehibridación es la misma que en las demás técnicas de hibridación: el bloqueo de posibles uniones inespecíficas de la sonda, en este caso al tejido.
Se realiza inundando el tejido en solución de prehibridación que contiene ADN de esperma de salmón fragmentado.
HIBRIDACIÓN
Se deposita sobre el tejido una pequeña cantidad de sonda (5ul), se coloca un cubreobjetos encima, evitando la formación de burbujas y se coloca el portaobjetos sobre una placa calefactora a 95ºC durante 5-10 minutos.
La detección de secuencias de ARN con sondas de ARN no requiere este paso de
desnaturalización. A continuación, el portaobjetos se coloca en una cámara húmeda para evitar la desecación de la sonda y se incuba a la temperatura y el tiempo recomendados por el fabricante.
LAVADO POSHIBRIDACIÓN
Tras la incubación de hibridación, los portaobjetos se lavan por inmersión en soluciones de poshibridación colocadas en cubetas Coplin.
DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
Las sondas utilizadas se marcan con haptenos y se detectan por métodos inmunohistoquímicos indirectos, con lo que se obtiene al final un producto coloreado que se deposita en el tejido alrededor del híbrido.
CONTRATINCIÓN
Tras el revelado del marcaje, en el tejido aparecen manchas coloreadas en las regiones en que se encuentra la secuencia diana. Sin embargo, el resto del tejido no es visible al microscopio, por lo que no se puede interpretar el resultado.
Por eso es necesario contrateñir el tejido con tinción suave, que no enmascare el resultado de la ISH, pero permita analizar el resultado en el contexto de detalles morfológicos.
VISUALIZACIÓN
Las preparaciones se visualizan con un microscopio óptico de luz transmitida.