REACTIVOS

PRACT 5: ELECTROFORESIS EN GELES DISCONTINUOS DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS 

Acrilamida 40% Metilen-bis-acrilamida 2% SDS TEMED Persulfato amónico. Tris Glicina HCl Metanol Ácido acético. Azul Coomassie 2-β-mercaptoetanol Azul de bromofenol Hielo

1. Limpiar los cristales con agua abundante y después con Etanol y Acetona para eliminar restos de grasa. 2. Montar los cristales en el sistema de electroforesis. 3. Preparación del gel separador. Se preparan 30 ml de volumen final de un gel 12% acrilamida/bisacrilamida 4. Se vierte entre los dos vidrios hasta una altura de 2,5 cm desde el borde de los cristales, dejando un pequeño volumen en el vaso de precipitado para comprobar la polimerización. 5. Añadir con cuidado 0,2 mL de isopropanol para definir perfectamente el borde del gel y no quede con ondulaciones. Una vez polimerizado se quita todo el isopropanol antes de añadir el gel apilador 6. Preparación del gel apilador. Se preparan 10 ml de volumen final de un gel 4% acrilamida/bisacrilamida 7. Cuando el gel separador ha polimerizado completamente, se vierte el gel concentrador hasta rellenar todo el espacio entre los vidrios e inmediatamente se coloca el peine que definirá los pocillos para las muestras 8. Una vez polimerizado, quitar el peine en vertical y con cuidado. 9. Rellenar los pocillos con tampón Tris pH=8,3 y con una pipeta eliminar el tampón, 10. Preparación de las muestras se preparan las muestras mezclándolas con el tampón de carga de la siguiente manera: - 10µL de muestra - 10µL de tampón de carga Tris/HCl 0,125 M pH 6,8 SDS 4% Glicerol 20% azul de bromofenol 0,1% - 2 µL de 2-β-mercaptoetanol 11. Calentar la mezcla en un baño hirviendo durante 5 min. 12. Pasar a hielo. 13. Colocar el portador de geles en el aparato de electroforesis, eliminar todo el tampón, rellenar la cubeta con 300 mL del tampón de electrodo compuesto por: Tris-base 0,025 M, pH 8,3 Glicina 0,192 M SDS 0,1% 15. Aplicar el campo eléctrico a 200 voltios y una vez transcurrida la electroforesis desconectamos la fuente de alimentación Quitamos los cristales y lo pondremos a teñir manteniéndolo en una solución compuesta por: metanol 40% ácido acético 10% Coomassie Blue R-250 0,125%.